pH、温度和冻融对外泌体数量变化和细胞摄取的影响

      外泌体是由多泡体（MVB）与质膜融合时，释放到细胞外的具有双层膜结构的小细胞外囊泡（30-150nm），含有介导细胞间通讯的蛋白质，mRNA和miRNA等。几乎所有细胞都可以分泌外泌体, 且外泌体存在于各种生物体液中，如血液，尿液，唾液，胸腔积液和母乳。到目前为止，许多研究已经证明外泌体在疾病发展中的功能以及在诊断和治疗中的潜在临床应用。为了对外泌体的内容物和功能进行可重复研究，需要对外泌体影响最小的储存条件。       已有研究提供了目前不同储存条件对外泌体影响的部分证实。通过Western blot研究了储存温度对尿液和条件培养基外泌体的影响，两组均得出结论，长时间储存温度低于-70°C是外泌体恢复的zui佳温度。另一方面，Sokolova等人应用纳米粒子跟踪分析（NTA）来探究外泌体在不同温度下的大小变化，发现37℃条件储存下的外泌体大小要比4℃条件下更小。但在该研究中尚未报道有关外泌体颗粒浓度变化。其他一些研究揭示了pH、储存温度、冷冻和解冻循环jin对外泌体分离产量的影响，而不是储存期间数量变化的影响。因此，外泌体保存条件的标准仍未定义。      上海交通大学生物医学工程与Med-X研究所团队在 Protein&Cell上发表了“Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes”，使用HEK 293T细胞和ExtraPEG方法来研究多种储存条件（温度，冷冻和解冻循环，pH）对外泌体的数量变化和细胞摄取的影响。ExtraPEG是一种新的聚乙二醇（PEG）沉淀方法，用于纯化外泌体而不影响其生物活性。通常，超速离心（UC）是zui可靠但耗时的沉淀方法，而沉淀方法如ExoQuick和ExtraPEG可以获得更高产率的外泌体，但有共沉淀蛋白质的存在。首先，通过ExtraPEG或UC方法提取来自条件培养基的外泌体。分离后，TEM和NTA显示UC或ExtraPEG提取的外泌体具有相似的茶托状结构和大小分布，且Western blot可检测到外泌体标志物ALIX、HSP70、和TSG101，而未检测到阴性指标β-tubulin。表明了ExtraPEG方法可成功分离外泌体，适用于以下实验。      将分离得到的外泌体分成几个部分，每个部分在不同温度（-80℃，-20℃，4℃，37℃和60℃）下储存，或通过1-5个循环冷冻至-80℃并解冻，或在不同的pH水平（pH4，pH7和pH10）下冷冻。24hrs后，进行NTA和Western blot以测量外泌体的剩余量。关于温度，在4℃下储存的外泌体具有zui高浓度。与NTA结果一致，在4℃下储存的外泌体检测出的ALIX，HSP70和TSG101的蛋白表达水平更高。随着冷冻和循环解冻次数的增加，外泌体浓度以及ALIX，HSP70和TSG101的蛋白质水平均有所下降。对于不同的pH水平，在pH 4和pH 10下外泌体浓度和三种ALIX，HSP70和TSG101的损失大于在pH 7下的损失。有趣的是，在pH 4下储存的外泌体比在pH 10下的外泌体浓度下降得更多，表明酸性环境对外泌体稳定性更具破坏性。NTA数据显示不同温度组之间，不同的冷冻和解冻循环以及不同的pH组的外泌体大小没有明显差异，这表明外泌体不会分解成较小的或融合成的较大的囊泡，但在储存期间会有大部分外泌体降解。接下来还检测了在不同温度（-80℃，-20℃，4℃）下长期储存的外泌体相关蛋白的水平，ALIX、HSP70和TSG101的水平随时间的增加，-80℃的降解率低于-20℃和4℃的降解率。                        Figure1:不同贮藏条件对外泌体数量变化的影响（A，D和F）通过NTA检测在不同条件下储存24hrs的外泌体的相对浓度。（A）不同的温度，（D）不同的冷冻和解冻循环，（F）不同的pH值。 （B，E和G）样品在不同条件下储存24hrs后，通过Western blot检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的表达水平。（B）不同的温度，（E）不同的冷冻和解冻循环，（G）不同的pH值与pH7相比。 （C）在外泌体储存于-80°后，通过Western blot检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的表达水平。     为研究不同储存条件对外泌体细胞摄取的影响，将PKH26标记的外泌体平均分成几个部分，每个部分在不同温度下保存（-80°C，-20°C，4°C，37 °C和60°C），或通过1-5个循环的冷冻至-80°C和解冻，或在不同的pH水平（pH 4，pH 7和pH 10），然后将它们与293T细胞一起孵育指定的时间。初步实验结果表明，3 hrs适合细胞摄取外泌体，孵育较长时间会增加外泌体的聚集和计数的难度。荧光图像显示单个外泌体和聚集的外泌体非常接近细胞核，这意味着它们都可被细胞摄取。忽略聚集的外泌体，外泌体在-80℃，-20℃，37℃和60℃下储存后，细胞吸收的单个外泌体比4℃时更多。并且随着冷冻和解冻循环的增加，单个外泌体的数量减少，但考虑到外泌体浓度的降低，外泌体的细胞摄取实际上没有发生重大变化。至于pH，在pH4和pH10下的储存导致细胞对外泌体的摄取比在pH7下更多。                            Figure2:不同贮藏条件对外泌体细胞摄取的影响 （A）将PKH26标记的外泌体在不同条件下储存24hrs，再与293T细胞共孵育3hrs，DAPI染细胞核。（B-D）通过计数红色荧光信号的数量来定量细胞摄取的外泌体.（B）不同的温度.（C）不同的冷冻和解冻循环.（D）不同的pH水平        为了评估牛外泌体对实验的影响，进行NTA以测量外泌体在293T细胞条件培养基（50mL），FBS（50mL含10％FBS的DMEM），无外源FBS（50mL含10％无外源FBS的DMEM）中的浓度，同时分析了无外泌体细胞培养基中的外泌体在不同条件下储存24hrs后的浓度变化。结果显示，293T细胞分泌的外泌体远远超过FBS中的牛外泌体，并且在无外源FBS中保留的牛外泌体很少。且NTA结果显示不同储存条件对来自无外泌体条件培养基的外泌体的影响与来自正常条件培养基的外泌体的影响一致。      人们普遍认为外泌体可以在-80°C下长时间保存，而室温（RT）以上的温度则不适合外泌体的储存。但关于零下温度对外泌体的短时间储存的影响知之甚少。作者的研究发现，与4℃相比，外泌体储存在37℃、60℃、-20℃和-80℃ 24hrs后外泌体浓度表现不同程度的降低，但外泌体被细胞摄取的量表现不同程度的增加。表明，相对较高的温度和冻融循环可能会影响外泌体膜并改变其特性，使外泌体更容易被细胞摄取。但需要进一步的生化研究来验证这一假设。     一些报道显示酸性pH可减少外泌体相关蛋白的降解，且将pH值调节至7以下的条件培养基或尿液在室温下孵育30min后，可分离出更高多的外泌体。但是作者，在pH 4的储存条件下，外泌体的浓度会降低，且增加了外泌体被细胞摄取的量。并且这些发现可以通过以下证据得到证实：负载阿霉素的外泌体在pH5下比在pH7.4时更快且大量释放，并且另一个证据表明外泌体释放和摄取增加发生在酸性环境中。总之，pH对外泌体影响的研究值得进一步研究。      因此，研究提供了关于储存条件对外泌体影响的相对全面的信息，这对于更好地保存外泌体非常有用，并且对于将来的外泌体功能和应用研究具有重要意义。